Ezio se întoarce și luptă împotriva puternicului Ordin Templier. Acum, ca legendarul Maestru Asasin, trebuie să călătorească la Roma, centrul puterii, lăcomiei și corupției, pentru a lovi în inima inamicului. Ezio va conduce o întreagă Frăție, care se va aduna alături de el, și doar lucrând împreună pot Asasinii să-și învingă dușmanii de moarte.

Assassin's Creed Brotherhood oferă, de asemenea, un element multiplayer complet inovator, unde jucătorii vor putea asista Templierii, folosind Abstergo pentru a se antrena în arta asasinatului, pentru a elimina Asasinii o dată pentru totdeauna. Jucătorii vor avea posibilitatea de a alege dintr-o gamă de personaje unice - fiecare dintre ele având propriile arme și tehnici distincte de asasinat - și de a-și combina abilitățile împotriva altor jucători din întreaga lume în diferite moduri de joc.