Intriga începe când Bruce Wayne este închis în Arkham City, o zonă izolată a Gothamului transformată într-o închisoare deschisă sub controlul profesorului Hugo Strange. Strange cunoaște identitatea lui Batman și plănuiește să activeze Protocolul 10, un plan de exterminare în masă a deținuților. În același timp, Jokerul, otrăvit de propria sa formulă Titan, îl infectează pe Batman cu sângele său, forțându-l să găsească un leac.

Pe măsură ce Batman investighează, se confruntă cu mulți dușmani emblematici precum Two-Face, Penguin, Mr. Freeze, Harley Quinn, Riddler și Ra’s al Ghul. Povestea atinge punctul culminant cu dezvăluirea Protocolului 10 ca un plan de genocid și lupta finală cu Jokerul, care moare când leacul este distrus. Jocul se încheie cu Batman care transportă trupul neînsuflețit al lui Joker în afara Arkham City, într-una dintre cele mai dramatice scene din serie.